Il sequenziamento del DNA secondo il metodo Sanger prevede l’allestimento di una miscela di reazione nella quale, oltre al DNA, devono essere presenti altri componenti; quale tra quelli elencati NON è un componente necessario per la reazione?
Il metodo Sanger non fa rigorosamente parte del programma anche se potrebbe ricadere in “Genetica molecolare: struttura e duplicazione del DNA” oppure in “Le biotecnologie: la tecnologia del DNA ricombinante e le sue applicazioni”.
Ad ogni modo è indubbio si tratti di una metodica che ha rivoluzionato il mondo della genetica molecolare e delle biotecnologie applicate alla genetica.
Come sempre di fronter ad un quiz di questo tipo il consiglio è quello di affrontarlo solo se si conosce l’argomento senza basarsi su supposizioni personali.
Tale metodo consiste nel determinare la sintesi di tanti spezzoni di DNA a partire da un DNA noto. Gli spezzoni dipendono dal fatto che Sanger ideò di usare nucleotidi contenenti didesossiribosio, una variante del desossiribosio priva dell’ossidrile anche in 3’ e non solo in 2’. Questi nucleotidi sono naturalmente “terminatori” della sequenza non potendo legare nulla in 3’. Ricordiamo che l’allungamento delle catene di nucleotidi (DNA o RNA è lo stesso) avviene sempre da 5’ a 3’, legando cioè il fosfato del nuovo nucleotide all’ossidrile in 3’ dell’ultimo della nuova catena, se in 3’ l’ossidrile non c’è la catena s’interrompe. Usando contemporaneamente normali nucleotidi trifosfato (in abbondanza) e didesossiribonucleotidi, molte catene si allungano normalmente, ma alcune s’interrompono, via via in ogni sede in cui è previsto il nucleotide con quella basa azotata. Così si creerà, per ogni singolo didesossi-nucleotide trifosfato impiegato, tutta la possibile serie di spezzoni che interrompono la catena in ogni sede in cui sia presente quel nucleotide. Questo consentirà, mediante elettroforesi su gel, di separare tutti questi spezzoni per poi amplificarli (con la PCR) ed analizzarli. Inizialmente il metodo prevedeva l’impiego di un solo tipo di dideossiribonucleotide trifosfato per volta poi, usando dideossiribonucleotidi trifosfato marcati, si è passato all’uso contemporaneo di tutti i quattro tipi, velocizzando il lavoro.
Alla luce di ciò, cosa non serve di quanto proposto nelle risposte?
Corretta la risposta C). Le DNA ligasi, infatti non si deve legare nulla anzi, il metodo si basa proprio sulla produzione di frammenti altamente significativi.
